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【新品速递】天昊生物推出微生物16S扩增子绝对定量测序服务

发稿时间:2018-09-27来源:天昊生物


1.技术简介

        16S rRNA基因扩增子高通量测序,是通过对基因组目的区域进行PCR扩增,将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序的研究策略,可有效研究特定环境中的物种信息,检测几十至几百种微生物特性。近来,特定环境样本中某一类群微生物的绝对定量问题受到越来越多研究学者的关注,以往都是通过特定物种的qPCR绝对定量进行检测,但qPCR定量实验结果常常不稳定,且特定物种qPCR需要设计特定引物,对引物特异性要求较高,且引物优化难度较大,导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。目前,16S rRNA基因测序手段通过某一OTU分类单元的序列数占总序列数的比值来获得相对丰度数据,然而相对丰度信息不能反映环境样本中物种绝对丰度情况,而基于16S spike-in standards微生物绝对定量测序恰好能够获得环境样本中物种的绝对丰度数据。

该方法通过向样品DNA中添加一定量spike-in standards人工合 成序列,进行16S扩增子文库构建、测序,再根据spike-in standards 的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线,计算出样品中OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。添加16S spike-in standards到样品模板中进行16S rRNA基因扩增子高通量测序较好的解决了环境样本中微生物的绝对定量问题,同时也能得到环境样本中的物种组成信息。

说明:由于该方法需要额外添加外源核算序列,且对样本的DNA要求也较高,因此目前阶段只适合做一些常规的环境样本 (常规土壤样本,人粪便样本)


2.技术优势

  • 数据量大不低于15reads/样品,可检测环境微生物群落中的痕量菌,以及发现新的微生物。
  • 方案经济便捷:单个16S扩增子测序可同时获得样本中微生物的组成信息和绝对定量数据。
  •  适用范围广:可同时得到环境样本中绝大多数优势物种的绝对定量数据,该方法具有普遍适用性。
  •  真实、准确:绝对定量数据,测序结果真实,客观还原菌群结构及丰度比例,无样品偏差可直接比较。 

3应用领域

  • 微生物菌种绝对定量
  •  微生物菌群进化分析
  • 微生物菌群丰度分析
  • 环境与生态研究
  • 疾病和个体化医疗

4.技术参数

测序类型

推荐区域

样品要求

测序策略

数据要求

微生物16S扩增子绝对定量测序

V3

V4

V3+V4

V4+V5

样品类型:常规土壤样本和人粪便DNA,无明显降解;

样品需求量:总量>500ng;浓度≥20ng/μL

纯度:OD260/280=1.7-2.0

Illumina 2×250

Illumina 2×150

每个样本有效序列15万条spike-in序列占总序列10%~50%Raw data Q30数据达到70%以上,Clean data Q30数据达到80%以上

 

 

5.技术路线

 

6.分析内容

标准分析

数据统计与优化

OTU分类分析

原始序列数据统计

优化序列数据统计

OTU聚类分析

分类学分析

/

/

物种注释统计

进化树分析

 

 

OTU绝对定量

/

/

样本OTU Id对应的物种绝对拷贝数统计

 

群落组成分析

Alpha多样性分析

单样本物种组成饼图

单样本多级物种组成图

多样性指数分析

多样性指数差异分析

分类学系统组成树

物种总丰度柱状图

稀释性曲线

Shannon-Wiener曲线

丰度分布Bubble

多样本群落结构柱状图

Rank-Abundance曲线

物种累积曲线

样本聚类树柱状图

Heatmap热图

/

/

Metastats分析

/

/

/

Beta多样性分析

/

Venn图分析

样本聚类树图

/

/

PCA分析

PCoA分析

/

/

NMDS分析

ADONIS分析

/

/

Lefse分析

/

/

/

高级分析项目

环境因子分析

可选分析

Mantel test分析

Bioenv分析

PD分析

3D-PCoA分析

物种与环境因子相关性分析

RDA/CCA分析

PLS-DA分析

ANOSIM分析

/

/

Metagenomeseq分析

Wilcoxon秩和检验/ANOVA分析

/

/

PICRUSt功能分析

优势物种网络图分析

/

/

Indicator分析

OTU富集三元相图


7.服务流程

 


8. 结果展示

 

1) 样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算

a) 16S V4区扩增子测序的DNA模板中样品DNA和spike-in DNA添加情况

模板编号

模板中spike-in 拷贝数

模板中样本DNA

样本信息

Y1_V4

2.67E+07 copies

5 ng

粪便样本

Y3_V4

2.67E+06copies

5 ng

土壤样本

Y4_V4

2.67E+07 copies

5 ng

淤泥样本A

Y7_V4

2.67E+06copies

5 ng

土壤样本

Y42_V4

2.67E+06copies

5 ng

淤泥样本A

注: Y4_V4Y42_V4是同一个样本分别添加2.67E+07 copies和2.67E+06 copiesspike-in DNA后的混合样本。


b) 根据spike-in序列制作标准曲线(以Y4为例),计算优势OTU代表序列物种起始拷贝数:

1 Y4_V4 样品中spike-in序列数及拷贝数

spike-in序列编号

spike-in序列数

OTUreads

spike-in 拷贝数

copies

spike-in序列数取log

logOTUreads

spike-in 拷贝数取log

logcopies

spike_1

68841

1.20E+07

4.837847

7.079061

spike_2

55078

1.20E+07

4.740978

7.079061

spike_3

9155

1.20E+06

3.961658

6.079061

spike_4

7949

1.20E+06

3.900312

6.079061

spike_5

1085

1.20E+05

3.03543

5.079061

spike_6

1034

1.20E+05

3.014521

5.079061

spike_7

72

1.20E+04

1.857332

4.079061

spike_8

66

1.20E+04

1.819544

4.079061

spike_9

66

1.20E+04

1.819544

4.079061


c) logcopies)为横坐标,logreads)为横坐标,制作标准曲线如下:

 

1 Y4样品的标准曲线

d) 标准曲线如下根据标准曲线计算的测试样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数:

表2  根据标准曲线计算的测试样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数

#OTU ID

Y4_V4

OTUreads 

Y4_V4

copies

Y4_V4

logOTUreads

Y4_V4

logcopies

OTU60

47754

7.72E+06

4.67901

6.887707

OTU8

6052

9.55E+05

3.781899

5.980068

OTU73

3820

6.00E+05

3.582063

5.777887

OTU63

3650

5.73E+05

3.562293

5.757884

OTU72

3028

4.74E+05

3.481156

5.675795

OTU71

3017

4.72E+05

3.479575

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